A microscopia óptica é uma técnica fundamental para compreender processos biológicos dinâmicos nas células, mas observar essas dinâmicas celulares rápidas com precisão e alta resolução espacial tem sido uma tarefa desafiadora.
Agora, em um artigo publicado na Light: Science & Applications, pesquisadores da Universidade de Osaka, juntamente com instituições colaboradoras, revelaram uma técnica de microscopia crio-óptica que captura uma imagem quantitativamente precisa e de alta resolução em um momento selecionado durante a atividade celular dinâmica. Capturar eventos celulares dinâmicos rápidos com detalhe espacial e quantificabilidade tem sido um grande desafio devido a um compromisso fundamental entre a resolução temporal e o ‘orçamento de fótons’, ou seja, a quantidade de luz que pode ser coletada para a imagem. Com fótons limitados e imagens apenas fracas e ruidosas, características importantes no espaço e no tempo são perdidas no ruído.
“Em vez de perseguir a velocidade na imagem, decidimos congelar toda a cena,” explica um dos autores principais, Kosuke Tsuji. “Desenvolvemos uma câmara especial de congelamento de amostras para combinar as vantagens da microscopia de células vivas e da microscopia de crio-fixação. Ao congelar rapidamente células vivas sob o microscópio óptico, conseguimos observar uma imagem congelada das dinâmicas celulares com alta resolução.”
Por exemplo, a equipe congelou a propagação de ondas de íons de cálcio em células de músculo cardíaco vivas. A onda congelada, intrincadamente detalhada, foi então observada em três dimensões usando uma técnica de super-resolução que normalmente não pode observar dinâmicas celulares rápidas devido à sua velocidade de aquisição de imagem lenta.
“Esta pesquisa começou com uma mudança ousada de perspectiva: arrestar processos celulares dinâmicos durante a imagem ótica em vez de lutar para rastreá-los em movimento. Acreditamos que isso servirá como uma técnica fundamental poderosa, oferecendo novas percepções em pesquisas na área de ciências da vida e medicina,” diz o autor sênior Katsumasa Fujita. Um dos autores principais, Masahito Yamanaka, acrescenta: “Nossa técnica preserva tanto características espaciais quanto temporais de células vivas com congelamento instantâneo, tornando possível observar seus estados em detalhe. Enquanto as células estão imobilizadas, podemos aproveitar a oportunidade para realizar medições quantitativas altamente precisas com uma variedade de ferramentas de microscopia óptica.”
Os pesquisadores também demonstraram como essa técnica melhora a precisão de quantificação. Ao congelar células marcadas com um probe fluorescente de íons de cálcio, eles puderam usar tempos de exposição 1000 vezes mais longos do que o prático em imagens de células vivas, aumentando substancialmente a precisão da medição.
Para capturar eventos biológicos transitórios em momentos precisamente definidos, os pesquisadores integraram um sistema de injeção de criógeno acionado eletricamente. Com estimulação de luz UV para induzir ondas de íons de cálcio, esse sistema permitiu o congelamento das ondas de cálcio em um momento específico após o início do evento, com precisão de 10 ms. Isso permitiu à equipe arrestar processos biológicos transitórios com uma precisão temporal sem precedentes.
Finalmente, a equipe focou na combinação de diferentes técnicas de imagem, que geralmente são difíceis de alinhar temporalmente. Com o congelamento quase instantâneo das amostras, múltiplas modalidades de imagem podem agora ser aplicadas sequencialmente sem se preocupar com discrepâncias temporais. Em seu estudo, a equipe combinou microscopia de Raman espontânea e microscopia de fluorescência de super-resolução nas mesmas células criogenicamente fixadas. Isso lhes permitiu visualizar informações celulares intrincadas de várias perspectivas exatamente no mesmo ponto no tempo.
Essa inovação abre novas avenidas para observar eventos celulares rápidos e transitórios, fornecendo aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para explorar os mecanismos subjacentes a processos biológicos dinâmicos.